Sebelum sebuah material baru boleh ditanamkan ke tulang manusia, ia harus melewati ujian yang jauh lebih teliti dari sekadar uji kekuatan mekanik. Ia harus “dilihat” dari dalam, sel demi sel, di bawah lensa mikroskop. Pertanyaannya: metode pewarnaan mana yang paling tepat untuk membaca cerita itu?
Itulah inti pertanyaan yang dijawab oleh tim peneliti dari Departemen Biomedika Kedokteran Gigi FKG UGM bersama mitra dari Radboud University Nijmegen Medical Center, Belanda. Studi mereka, yang dipublikasikan di Majalah Kedokteran Gigi Indonesia edisi April 2023, membandingkan lima metode pewarnaan histologis untuk mengevaluasi respons seluler terhadap material scaffold regenerasi tulang berbasis gipsum dan kalsium karbonat.
Dua Puluh Tikus, Lima Cara Mewarnai
Dua puluh ekor tikus Wistar jantan, berusia empat bulan dengan berat 250–350 gram, menjadi subjek penelitian ini. Mereka dibagi ke dalam dua kelompok besar: implan subkutan dan implan tulang, lalu diamati pada tiga titik waktu: 3, 14, dan 30 hari pasca-implantasi.
Material yang diuji adalah scaffold biodegradable berbahan dasar campuran gipsum, kalsium karbonat, dan gelatin. Setelah masa observasi berakhir, jaringan di sekitar implan diangkat, diproses melalui dekalsifikasi dengan larutan EDTA (ethylenedinitril-o-tetra-acetic acid) selama dua hingga empat minggu, lalu diwarnai dengan lima metode berbeda: Hematoxylin Eosin (HE), Mallory, Toluidine Blue, TRAP (Tartrate-resistant acid phosphatase), dan DAB (Chromogen 3,3′-diaminobenzidine) sebagai bagian dari imunohistokimia.
Pengamatan dilakukan menggunakan mikroskop cahaya Nikon Eclipse E600 dengan pembesaran 10×10 hingga 100×10, dibantu perangkat lunak Optilabviewer.
HE: Murah dan Serba Guna, tapi Ada Batasnya
Pewarnaan HE adalah metode yang paling sering dipilih karena murah dan mudah dikerjakan. Prinsipnya sederhana: kromatin inti sel mengikat hematoxylin (warna ungu-biru), sementara protein sitoplasma mengikat eosin (warna merah muda). Dengan kombinasi ini, sel-sel inflamasi seperti neutrofil, makrofag, limfosit, dan sel raksasa berinti banyak (giant cells) dapat diidentifikasi, begitu pula keberadaan pembuluh darah baru dan serat kolagen.
Pada pengamatan hari ketiga pasca-implan subkutan, leukosit PMN terutama neutrofil dan makrofag mendominasi gambaran histologis. Empat belas hari kemudian, pembuluh darah baru mulai tampak di sekitar serat kolagen yang menebal di antara fibroblas. Namun ketika harus membedakan kontras material implan yang tersisa dari jaringan sekitarnya, HE menunjukkan keterbatasannya.
Di sinilah metode-metode lain mengambil peran masing-masing.
Ketika Warna Kontras Lebih Bicara
Pewarnaan Mallory unggul dalam memperlihatkan ketebalan serat kolagen, yang menjadi penanda proses regenerasi jaringan baru. Serat kolagen tampil dalam biru tua yang khas, sementara tulang di sekitar defek terlihat jauh lebih kontras dibandingkan dengan HE. Penilaian kerapatan kolagen dilakukan dengan sistem skor 0–3: dari tidak ada serat kolagen sama sekali hingga serat yang menebal membentuk matriks ekstraseluler.
Metode TRAP dirancang khusus untuk memvisualisasikan osteoklas, sel yang bertanggung jawab atas resorpsi tulang. Dengan pewarnaan TRAP, osteoklas tampil dalam warna merah tua yang mencolok di atas latar tulang berwarna hijau, terletak di cerukan-cerukan yang dikenal sebagai Howship’s lacunae. Kontras ini jauh lebih tegas dibandingkan HE, di mana warna osteoklas nyaris menyatu dengan jaringan sekitarnya.
Toluidine Blue, di sisi lain, bekerja dengan afinitas tinggi terhadap komponen jaringan yang bersifat asam, termasuk DNA dan RNA. Metode ini terutama digunakan untuk mengidentifikasi sel mast, sekaligus menunjukkan kematangan tulang baru melalui gradasi warna biru: semakin tua dan matang tulangnya, semakin pekat warna birunya.
“Tissue staining techniques with immunohistochemistry (DAB, VEGF) are used to evaluate cell and tissue responses by identifying specific proteins present.”
Kalimat itu ringkas, tapi implikasinya dalam. Pewarnaan imunohistokimia dengan DAB membuka dimensi yang tidak bisa dijangkau metode konvensional: identifikasi protein spesifik, mulai dari mediator inflamasi seperti IL-8 dan IL-1β, faktor pertumbuhan pembuluh darah (VEGF), hingga penanda sel imun tertentu. Intensitas warna cokelat yang dihasilkan DAB bahkan bisa dibaca secara semikuantitatif, dengan sistem skor dari 0 (negatif) hingga 4 (ekspresi lebih dari 90%).
Memilih Metode, Memilih Pertanyaan
Kesimpulan studi ini bukan tentang satu metode terbaik. Pesannya justru lebih nuansatif: pilihan metode pewarnaan bergantung pada pertanyaan ilmiah yang ingin dijawab.
Bila peneliti membutuhkan gambaran cepat tentang sel inflamasi secara umum, HE sudah memadai. Bila fokusnya pada dinamika remodeling tulang lewat rasio osteoblas-osteoklas, TRAP adalah pilihan yang lebih tajam. Bila regenerasi jaringan diukur dari kerapatan kolagen, Mallory memberi kontras yang lebih informatif. Dan bila pertanyaannya menyentuh ekspresi protein spesifik dalam proses inflamasi atau angiogenesis, imunohistokimia dengan DAB adalah satu-satunya jalan.
Studi ini juga menyinggung teknik imunofluoresensi ganda sebagai langkah lebih lanjut. Dengan dua antibodi berlabel fluorokrom berbeda, peneliti bisa mendeteksi kolokalisasi dua protein sekaligus dalam satu irisan jaringan, misalnya menandai makrofag (CD68) yang sekaligus mengekspresikan caspase-3 sebagai penanda apoptosis. Hasilnya tampil dalam warna jingga, superimposisi antara merah dan hijau di bawah mikroskop fluoresensi.
Material scaffold tulang yang aman secara klinis tidak lahir dari satu uji tunggal. Ia lahir dari proses panjang yang dimulai dengan pertanyaan kecil di bawah kaca pembesar, dengan pilihan warna yang tepat untuk membaca jawaban yang benar.
Penulis: Hazra Alifia Muharam, drg. Achmad Zam Zam Aghasy, M.Kes.
Foto: Pict generate by Gemini AI
